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Lipo3K轉(zhuǎn)染試劑

Lipo3K轉(zhuǎn)染試劑

Lipo3K?Transfection Reagent產(chǎn)品簡介:Lipo3K試劑采用了富百科脂質(zhì)納米顆粒LNP遞送技術(shù), 利用脂質(zhì)形成納米微粒將核酸包裹起來形成核酸脂質(zhì)納米粒,實現(xiàn)高轉(zhuǎn)染性和可重復(fù)性的實驗結(jié)果。其可針對廣泛類型的常見及難轉(zhuǎn)染細胞,實現(xiàn)超高轉(zhuǎn)染效率,同時提供更高的細胞活力。Lipo3K對大多數(shù)細胞毒性低并且性質(zhì)溫和,并且我們優(yōu)化了轉(zhuǎn)染過程的全部四個步驟,并結(jié)合富百科脂質(zhì)體納米顆粒(LNP)遞送技術(shù),實現(xiàn)了較高的轉(zhuǎn)染性能并可以降低所需的試劑量,同時盡可能降低對細胞系產(chǎn)生毒性的風(fēng)險。對多種類型的細胞和培養(yǎng)板都具有高轉(zhuǎn)染效率;轉(zhuǎn)染時血...

Lipo3K?Transfection Reagent

產(chǎn)品簡介:

Lipo3K試劑采用了富百科脂質(zhì)納米顆粒LNP遞送技術(shù), 利用脂質(zhì)形成納米微粒將核酸包裹起來形成核酸脂質(zhì)納米粒,實現(xiàn)高轉(zhuǎn)染性和可重復(fù)性的實驗結(jié)果。其可針對廣泛類型的常見及難轉(zhuǎn)染細胞,實現(xiàn)超高轉(zhuǎn)染效率,同時提供更高的細胞活力。Lipo3K對大多數(shù)細胞毒性低并且性質(zhì)溫和,并且我們優(yōu)化了轉(zhuǎn)染過程的全部四個步驟,并結(jié)合富百科脂質(zhì)體納米顆粒(LNP)遞送技術(shù),實現(xiàn)了較高的轉(zhuǎn)染性能并可以降低所需的試劑量,同時盡可能降低對細胞系產(chǎn)生毒性的風(fēng)險。對多種類型的細胞和培養(yǎng)板都具有高轉(zhuǎn)染效率;轉(zhuǎn)染時血清的存在不影響轉(zhuǎn)染效率的優(yōu)點。

適用范圍:貼壁細胞和懸浮細胞(哺乳動物細胞系)的轉(zhuǎn)染。

1)???????卓越的轉(zhuǎn)染效率—針對較難轉(zhuǎn)染細胞,可將效率提升2~10倍

2)???????作用溫和,細胞毒性低—可改善細胞活力

3)???????高性價比高,同時實現(xiàn)更好的轉(zhuǎn)染結(jié)果

產(chǎn)品儲存:?2-4℃保存一年。(避免冷凍)

使用方法:?(每次轉(zhuǎn)染一定要進行預(yù)實驗,來摸索最佳條件,?尤其是轉(zhuǎn)染試劑的最佳用量!

DNA的轉(zhuǎn)染??

對大多數(shù)細胞來說,轉(zhuǎn)染時高的細胞密度可以得到高的轉(zhuǎn)染效率和表達水平,并能減少細胞毒性。

1.接種細胞至70-90%匯合度時轉(zhuǎn)染

2.按照下表使用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋Lipo3K-B試劑(建議同時用2管),充分混勻

3.?使用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋DNA,制備DNA預(yù)混液,然后添加Lipo3K-A?試劑,充分混勻。

4.?在每管已稀釋的Lipo3K-B試劑中加入稀釋的DNA (1:1比例)。

5.?室溫孵育5分鐘。

6.?加入DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物至細胞中。

7. 37℃孵育細胞2 - 4天。然后分析轉(zhuǎn)染細胞。

siRNA轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染siRNA至細胞中時,遵循如上所述的DNA實驗方案,但在稀釋siRNA時不要加入Lipo3K-A試劑(第3步)。

細胞培養(yǎng)容器


96-well

24-well

6-well

貼壁細胞


14 × 104

0.52 × 105

0.251 × 106

Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋Lipo3K-B試劑

(建議同時用2管)

Opti-MEM培養(yǎng)基

5 μL × 2?

25 μL × 2?

125 μL × 2

Lipo3K-B

0.150.3 μL?

0.751.5 μL?

3.757.5 μL

Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋DNA,制備DNA預(yù)混液,然后添加Lipo3K-A試劑,充分混勻

Opti-MEM培養(yǎng)基

10 μL

50 μL?

250 μL

DNA (0.5–5 μg/μL)?

0.2 μg?

1 μg?

5 μg

Lipo3K-A試劑(2 μL/μg DNA)

0.4 μL?

2 μL

10 μL

Lipo3K-B試劑中加入稀釋的DNA (1:1比例)

稀釋的DNA

5 μL?

25 μL

125 μL

稀釋的Lipo3K-B

5 μL?

25 μL?

125 μL

室溫孵育5分鐘

加入DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物至細胞中


96-well

24-well

6-well

DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物

10 μL?

50 μL?

250 μL

37°C孵育細胞2–4天。然后分析轉(zhuǎn)染細胞。

?

細胞轉(zhuǎn)染注意事項:?細胞/DNA/siRNA每次都不同,建議每次轉(zhuǎn)染一定要進行預(yù)實驗來摸索最佳條件,尤其是轉(zhuǎn)染試劑的最佳用量!

1)???????轉(zhuǎn)染試驗失敗需要找一下原因:DNA/siRNA,轉(zhuǎn)染試劑和細胞。轉(zhuǎn)染效率低要先排除一下是否是siRNA的問題,如果siRNA無效,換再好的轉(zhuǎn)染試劑也沒意義,可以用帶熒光標(biāo)記的control siRNA做一下看看,轉(zhuǎn)進去的話會有熒光的。確實轉(zhuǎn)染效率低,可以考慮換轉(zhuǎn)染試劑;毒性大則要減少轉(zhuǎn)染試劑的用量。

2)???????細胞的種類和狀態(tài)影響較大:轉(zhuǎn)染時細胞必須處于良好生長狀態(tài),轉(zhuǎn)染時細胞的密度一般鋪板率在達到70—80%最好(此時細胞處于對數(shù)生長期);

3)???????如果是貼壁細胞,應(yīng)保證貼壁在12~24小時在進行轉(zhuǎn)染,否則細胞轉(zhuǎn)染容易脫壁。對于貼壁生長細胞,一般要求在轉(zhuǎn)染前一日,必須應(yīng)用胰酶處理成單細胞懸液,重新接種于培養(yǎng)皿或瓶,轉(zhuǎn)染當(dāng)日的細胞密度以70-90%(貼壁細胞)或2×106-4×106細胞/ml(懸浮細胞)為宜,最好在轉(zhuǎn)染前4h換一次新鮮培養(yǎng)液。

4)???????質(zhì)粒的大小,質(zhì)量和用量對轉(zhuǎn)染效率很關(guān)鍵。

5)???????轉(zhuǎn)染時注意脂質(zhì)體和用量,過量的話對細胞毒性大也容易失敗。

6)???????轉(zhuǎn)染作用6小時一定記得要換含血清的培養(yǎng)基

7)???????培養(yǎng)基以及洗滌細胞和稀釋用的培養(yǎng)基要無血清、無雙抗。

8)???????轉(zhuǎn)染試劑對個別細胞可能有一定毒性,在轉(zhuǎn)染過程由于提高細胞的通透性因而不能在培養(yǎng)答基中添加抗生素。

9)???????高純度的DNA或RNA可獲得較高的轉(zhuǎn)染效率!用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA必須無蛋白質(zhì),無RNA和其他化學(xué)物質(zhì)的污染,OD260/280比值應(yīng)在1.8以上。血清中含有大量的蛋白質(zhì),在轉(zhuǎn)染過程中,帶負(fù)電的蛋白質(zhì)可能干擾陽離子脂質(zhì)體對核酸的吸附,影響轉(zhuǎn)染效率。另外,使用脂質(zhì)體等轉(zhuǎn)染試劑時,由于含血清轉(zhuǎn)染會將血清中的蛋白帶入細胞,引發(fā)細胞毒性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低,故用無血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染效果更好!

10)?????培養(yǎng)基中的血清:在開始準(zhǔn)備DNA和轉(zhuǎn)染試劑稀釋液時要使用無血清的培養(yǎng)基,因為血清會影響復(fù)合物的形成。其實,只要在DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物形成時不含血清,在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。

11)??????培養(yǎng)基中的抗生素:抗生素是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細胞無毒,但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性,使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低。

12)?????一般在轉(zhuǎn)染24-48h,靶基因即在細胞內(nèi)表達。根據(jù)不同的實驗?zāi)康模?4-48h后即可進行靶基因表達的檢測實驗。

13)?????如若建立穩(wěn)定的細胞系,則可對靶細胞進行篩選,根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物,常用的真核表達基因載體的標(biāo)志物有潮霉素和新霉素等。

14)?????建議設(shè)置陽性對照和陰性對照。


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