膜標(biāo)記技術(shù)PKH26紅色熒光細胞鏈接試劑盒?
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit?
儲存條件：避光冷藏，如有結(jié)晶需在37℃水浴溶晶。因在乙醇中貯藏，所以要蓋緊防揮發(fā)。稀釋液C：常溫或冰箱保存，保持無菌。
無菌操作示范步驟（總體積2ml，染色終濃度為2×10-6M PKH26染料和1×107細胞/ml，所有操作在20～25℃）
2.?400×g離心5分鐘形成松散的細胞團。注意：PKH26染料不能直接加到離心沉淀中，這樣會造成細胞染色不均一和細胞活力降低。
3.?離心后，小心吸棄上層清液，細胞團上剩余液體<25ul。注意：為得到可重復(fù)的實驗結(jié)果，在用稀釋液C重懸時，減少殘留培養(yǎng)基或緩沖液體積。
4.?加入1mL稀釋液C，用移液管輕輕吹打混勻，制備2×細胞懸液。重懸細胞保證完全離散，別震蕩，不要讓細胞在稀釋液C中保存太長時間。
注意：生理鹽的存在會使得染料結(jié)團并大幅降低染色效率。需確保染色時細胞懸浮于稀釋液C中，不含培養(yǎng)基或緩沖鹽。
5.?臨染色之前，將4μL PKH26乙醇溶液加入1mL稀釋液C中，充分混勻，配制的2×染色液（4×10-6M）。
注意1：為減少乙醇對細胞活率的影響，步驟5加入的染料使得步驟6中乙醇最終濃度不能超過1-2%。
注意2：如果所需染料最終濃度＜2×10-6M，需用100%乙醇將PKH26稀釋于另一單獨的容器中，以確保實驗結(jié)果的可重復(fù)性。
注意：由于染色瞬間完成，快速將細胞與染料混勻?qū)Φ玫矫髁?、均勻和可重?fù)的標(biāo)記結(jié)果非常重要。為獲得最佳效果應(yīng)采取下述措施：
??a.不要將PKH26染料直接加入含2×細胞的稀釋液C中。
??b.?將2×細胞懸液（步驟4）與2×染色液（步驟5）等體積混合。
??c.?調(diào)整2×細胞和2×染料的濃度避免染色體積太?。ǎ?00μL）或太大（＞5mL）。
??d.?用電動移液器快速將細胞和染料混勻。血清移液管混勻速度太慢而使得染色不均勻。震蕩和旋渦震蕩混勻同樣混勻較慢，染色均一性差。
??e.?分配體積盡量準(zhǔn)確，以保證樣品與樣品之間，實驗與實驗之間的可重復(fù)性。
7.?混勻后的染色的細胞25℃孵育的2-5min，定時輕輕顛倒離心管保證在25℃充分混勻。由于染色速度較快，延長孵育時間對實驗沒有幫助。
8.?加入等體積的血清（2mL）或加入等量血清或1%BSA中止染色反應(yīng)，孵育1min以結(jié)合多余的染料。
注意1：血清（或等效的蛋白濃度）為最優(yōu)的終止液。如果用完全培養(yǎng)基（含血清的組織培養(yǎng)基）替代，添加體積為10mL。
注意3：不要用無血清培養(yǎng)基或緩沖鹽，他們會使染料產(chǎn)生聚集。染料聚集使清洗過程中無法洗凈，使得分析過程中仍存在未標(biāo)記的細胞。
注意1：將重懸液轉(zhuǎn)移至新離心管中，減少了離心管壁殘留的染料對洗滌效率的影響；注意2：不要用稀釋液C清洗。
10.?最后一步清洗后，用10mL完全培養(yǎng)基重懸細胞評估細胞回收率，細胞活率和熒光強度。離心重懸細胞至所需活細胞濃度。
注意1：染色后的細胞可以用中性甲醛固定，避光條件下，熒光強度至少3周內(nèi)保持穩(wěn)定。
注意2：染色熒光強度一般為背景的100-1000倍。雖然染色的CV值與細胞種類有關(guān)，但熒光分布應(yīng)該盡量均勻?qū)ΨQ。
11.?熒光顯微鏡/流式細胞儀分析細胞。檢查細胞復(fù)蘇情況、傳代情況及熒光濃度。染色應(yīng)均勻，比本底熒光高100-1000倍。
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