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TRITC Phalloidin標(biāo)記鬼筆環(huán)肽  Actin-Tracker Red-Rhodamine (微絲紅色熒光探針)

TRITC Phalloidin標(biāo)記鬼筆環(huán)肽 Actin-Tracker Red-Rhodamine (微絲紅色熒光探針)

TRITC Phalloidin標(biāo)記鬼筆環(huán)肽Actin-Tracker Red-Rhodamine (微絲紅色熒光探針)?1.?產(chǎn)品簡(jiǎn)介:?????鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)是一種來(lái)源于毒蕈類鬼筆鵝膏(Amanita phalloides)的環(huán)狀七肽毒素,以高親和力(Kd= 20 nM) 選擇性結(jié)合于絲狀肌動(dòng)蛋白?F-actin,而不會(huì)與單體肌動(dòng)蛋白?G-actin?結(jié)合。鬼筆環(huán)肽衍生物也以相近的親和力結(jié)合于大小纖維,無(wú)論是動(dòng)植物來(lái)源的肌肉細(xì)胞或非肌肉細(xì)胞,按照每一個(gè)肌動(dòng)蛋白亞基約與一個(gè)鬼筆環(huán)肽分子的計(jì)量比結(jié)合, 且非特異性結(jié)合幾乎可忽略,染色區(qū)域和非染色區(qū)域辨識(shí)度非常明顯,因此,鬼筆環(huán)...

TRITC Phalloidin標(biāo)記鬼筆環(huán)肽

Actin-Tracker Red-Rhodamine (微絲紅色熒光探針)?

1.?產(chǎn)品簡(jiǎn)介:?????

鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)是一種來(lái)源于毒蕈類鬼筆鵝膏(Amanita phalloides)的環(huán)狀七肽毒素,以高親和力(Kd= 20 nM) 選擇性結(jié)合于絲狀肌動(dòng)蛋白?F-actin,而不會(huì)與單體肌動(dòng)蛋白?G-actin?結(jié)合。鬼筆環(huán)肽衍生物也以相近的親和力結(jié)合于大小纖維,無(wú)論是動(dòng)植物來(lái)源的肌肉細(xì)胞或非肌肉細(xì)胞,按照每一個(gè)肌動(dòng)蛋白亞基約與一個(gè)鬼筆環(huán)肽分子的計(jì)量比結(jié)合, 且非特異性結(jié)合幾乎可忽略,染色區(qū)域和非染色區(qū)域辨識(shí)度非常明顯,因此,鬼筆環(huán)肽衍生物特別適合替代肌動(dòng)蛋白(Actin)抗體進(jìn)行相關(guān)研究。另外,鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)的結(jié)合可以阻止絲狀肌動(dòng)蛋白(微絲)的解離,穩(wěn)定微絲結(jié)構(gòu),從而破壞微絲的聚合-去聚合的動(dòng)態(tài)平衡。此特性使得肌動(dòng)蛋白聚合發(fā)生的臨界濃度(CC)降至<1 μg/mL,因此,可用作一種聚合促進(jìn)劑。此外,鬼筆環(huán)肽還可抑制?F-actin?的?ATP?水解活性。

鬼筆環(huán)肽及其衍生物在納摩爾濃度即可對(duì)F-actin染色,是非常實(shí)用和方便的探針,通常用于組織切片或細(xì)胞培養(yǎng)物中?F-actin的特異性熒光染色。另外,鬼筆環(huán)肽及其衍生物很小,直徑約1.2~1.5nm,分子量<2000 Da,經(jīng)標(biāo)記后的F-actin仍維持許多標(biāo)記前的功能。比如,標(biāo)記的甘油抽提肌纖維仍能收縮;標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白絲仍能在固相肌球蛋白基質(zhì)中移動(dòng)。

本品為?TRITC(四甲基異硫氰酸羅丹明)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽,染色反應(yīng)特異性強(qiáng),對(duì)比性高,具有比?Actin?抗體更好的染色效果,適合用作?F-actin?的定性和定量檢測(cè)。另外,經(jīng)本品結(jié)合后的?F-actin?仍能維持?actin?自身具有的許多生物學(xué)特性。 且本品的結(jié)合沒有物種差異性,適用性廣泛。?本產(chǎn)品是凍干粉形式。

試劑盒組份:?

Cat No

Product Name

Size

Price

Storage

C2207S

TRITC Phalloidin?標(biāo)記鬼筆環(huán)肽

Actin-Tracker Red-Rhodamine (微絲紅色熒光探針)

300T

1200RMB

-20°C Protect from light??1 year

CAS#915013-10-4??

MW:1231.4

最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)(Ex/Em)

Ex540546nm;?Em565575nm

外觀(Appearance

紅色粉末(凍干粉)

溶解性(Solubility)

溶于DMSO、DMF、甲醇或者乙腈水溶液(20%)

多肽序列(Sequence?TRITC-bicyclic(Ala-DThr-Cys-cis-4-hydroxy-Pro-Ala-2-mercapto-Trp-4-hydroxy-5-amino-L eu)(S-3 to 6)

操作步驟

1.染色液的配置

1)?母液的配置:使用前將本品回溫至室溫并簡(jiǎn)短離心,加入30uL DMSO使其充分溶解,混勻即可獲得1000×TRITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽母液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況,對(duì)其分裝并于-20℃避光干燥保存。

2)?工作液的配置:吸取1 μL以上TRITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽母液至1 mL PBS(含1%BSA)緩沖液中即可得到1×工作液。

【注】:不同的細(xì)胞染色情況不同,相應(yīng)TRITC鬼筆環(huán)肽使用量也需根據(jù)不同情況而定。推薦工作濃度為:80~200 nM。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.?染色步驟

1)細(xì)胞爬片生長(zhǎng)>24h,使其密度達(dá)到50~60%匯合度。

2)吸掉培養(yǎng)液,37℃預(yù)熱的1×PBS(pH 7.4)清洗細(xì)胞2次。

3)使用溶于PBS的4%甲醛溶液進(jìn)行細(xì)胞固定,室溫固定10~30min。

注意:避免固定劑中含有甲醇成分,因?yàn)榧状荚诠潭ㄟ^(guò)程中可能破壞肌動(dòng)蛋白。

4)室溫條件下,用PBS清洗細(xì)胞2~3次,每次10min。

5)室溫條件下,用丙酮(≤-20℃)脫水或者用0.5% Triton X-100溶液透化處理5min。

6)室溫條件下,用PBS清洗細(xì)胞2~3次,每次10min。

7)取100μL/孔(96孔板)配制好的?TRITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽工作液,覆蓋住蓋玻片上的細(xì)胞,室溫避光孵育30min(通常情況下,4℃~37℃孵育皆可)。

注意:為了降低背景,可于TRITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽工作液內(nèi)加入1% BSA;另外,孵育過(guò)程中為了避免溶液揮發(fā),可將蓋玻片轉(zhuǎn)移到一個(gè)密封的容器內(nèi)。

8)用PBS清洗蓋玻片3次,每次5min。

9)使用100 μL/孔(96孔板)即用型DAPI溶液(濃度:100 nM)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染,約30s。

10)用PBS清洗蓋玻片,然后倒置在已經(jīng)滴有一滴Fluoromount-GTM?水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫掉多余封片劑,然后用指甲油永久封片。此法制備的標(biāo)本玻片可置于4℃避光保存,通常6個(gè)月內(nèi)可繼續(xù)做F-actin染色分析。

11熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察,選擇?TRITC?激發(fā)/發(fā)射濾片(Ex/Em=545/570 nm)和?DAPI?激發(fā)/發(fā)射濾片(Ex/Em=364/454 nm

需要自備材料

1)???甲醇

2)???1×PBS緩沖液, pH 7.4,?細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別?

3)???固定液4%多聚甲醛(溶于PBS緩沖液)?

4)???丙酮或透化液0.5% Triton X-100(溶于PBS緩沖液)

5)???Fluoromount-GTM?水溶性封片劑(不含DAPI) ,DAPI?

6)???DAPI Fluoromount-GTM?水溶性封片劑(含DAPI)

7)???BSA,標(biāo)準(zhǔn)級(jí)別?

8)???載玻片和蓋玻片

9)???蓋玻片周圍密封液(如透明指甲油)

10)?組裝有FITC激發(fā)/發(fā)射濾片,以及DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片的熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡。

注意事項(xiàng):

1.???????熒光標(biāo)記鬼筆環(huán)肽的一個(gè)單位?(T)?的定義:按照推薦工作液濃度200nM?,每次用量為?100μL染色工作液時(shí),可以檢測(cè)的次數(shù)300次;按照工作液濃度100nM?,每次用量為?200?μL?染色工作液時(shí),可以檢測(cè)的次數(shù)也是300次。

2.???????鬼筆環(huán)肽具有毒性,需小心操作。

3.???????本產(chǎn)品為凍干粉形式,微量不易觀察?使用前瞬時(shí)離心,加溶劑溶解后使用,?溶解后接近無(wú)色。

4.???????產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員用于生命科學(xué)研究,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅。

5.???????產(chǎn)品必須由合格專業(yè)技術(shù)人員操作同時(shí)佩戴口罩/手套/實(shí)驗(yàn)服并遵守生物實(shí)驗(yàn)室安全操作規(guī)程!

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