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SulfoCy3 SE

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SulfoCy3 SESulfoCy和LipoCy為北京富百科生物技術(shù)有限公司注冊商標(biāo),未經(jīng)授權(quán)嚴(yán)禁使用!琥珀酰亞胺酯SE(Succinimidyl esters) = N-羥基琥珀酰亞胺NHS(N-Hydroxy succinimide)1.?產(chǎn)品簡介:??????菁染料是性能優(yōu)良的熒光標(biāo)記染料,摩爾吸光系數(shù)在熒光染料中是最高的,其琥珀酰亞胺酯是最常用的脂肪氨基標(biāo)記試劑,廣泛用于蛋白、抗體、核酸及其他生物分子的標(biāo)記和檢測。通過改變次甲基鏈的長度,?可改變其熒光發(fā)射波長,每增加一個雙鍵,按照Huoffman規(guī)則正好紅移約100nm。菁染料Cy3和Cy5已成為基因芯片的首選熒光標(biāo)記物;另外,Cy5, C...

SulfoCy3 SE

SulfoCy和LipoCy為北京富百科生物技術(shù)有限公司注冊商標(biāo),未經(jīng)授權(quán)嚴(yán)禁使用!

琥珀酰亞胺酯SE(Succinimidyl esters) = N-羥基琥珀酰亞胺NHS(N-Hydroxy succinimide)

1.?產(chǎn)品簡介

??????菁染料是性能優(yōu)良的熒光標(biāo)記染料,摩爾吸光系數(shù)在熒光染料中是最高的,其琥珀酰亞胺酯是最常用的脂肪氨基標(biāo)記試劑,廣泛用于蛋白、抗體、核酸及其他生物分子的標(biāo)記和檢測。通過改變次甲基鏈的長度,?可改變其熒光發(fā)射波長,每增加一個雙鍵,按照Huoffman規(guī)則正好紅移約100nm。

菁染料Cy3Cy5已成為基因芯片的首選熒光標(biāo)記物;另外,Cy5, Cy5.5Cy7的吸收在近紅外區(qū)背景非常低,是熒光強度最高、最穩(wěn)定的長波長染料。特別適合于活體小動物體內(nèi)成像代替放射性元素。

Cy3 SE.png


2.?菁染料琥珀酰亞胺酯(SulfoCy NHS)的標(biāo)記

菁染料和生物分子的比例F/P=412之間熒光強度最高,F/P值過高熒光探針會自我淬滅并影響生物分子的生物活性,標(biāo)記生物分子最好是用單琥珀酰亞胺酯,但是用雙修飾的CyDye NHS并沒有發(fā)現(xiàn)交聯(lián)。CyDye NHS標(biāo)記抗體在pH (8.59.4)10分鐘F/P可達(dá)56,而在pH 7.0幾乎不反應(yīng)。我們用不同比例的Cy3標(biāo)記anti-glutathione-S-transferase (GST)多克隆抗體發(fā)現(xiàn)用1:1, 5:1, 10:1?20:1標(biāo)記時得到的F/P值分別是0.28:1, 1.16:1, 2.3:1?4.6:1


3.?操作步驟

3.1?水溶性SulfoCy3 NHS標(biāo)記anti-GST多克隆抗體

???市場上買到的抗體如果含有其它蛋白(例如serum albumingelatin等)或帶氨基的緩沖液會影響標(biāo)記,在標(biāo)記前需純化。

1.?1 L 0.15 M NaCl?溶液中透析anti-GST抗體(濃度為0.5 mL at 3 mg/mL),常溫透析4小時。

2.?4°C用新鮮的1 L 0.15 M NaCl?溶液再透析過夜。

3.?第二天用1 L 0.1 M NaHCO3(pH 8.3)透析4小時。

4.?0.22 μm注射器過濾頭過濾抗體溶液。

5.?0.1 M NaHCO3稀釋少量的抗體,在280nm處測其紫外吸收值計算標(biāo)記抗體的總量IgG antibody摩爾吸光系數(shù)170 000 M-1cm-1at 280 nm).?

6.?用無水DMSO配置Cy3 NHS (MW 765.95)溶液濃度為10 mg/mL;計算所需體積以得到想要的CyDye NHS?和抗體的比值(例如20:1),然后慢慢將其加入到抗體溶液中,同時在暗處常溫緩慢攪拌45分鐘。(無水DMSO推薦使用SigmaAldrich貨號276855)

7.?1 L 0.15 M NaCl?溶液常溫避光透析4小時除去未標(biāo)記上的Cy3

8.?4°C用新鮮的1 L 0.15 M NaCl?溶液再避光透析過夜。

9.?1 L of 0.01 M PBS/ 0.01%?疊氮化鈉溶液常溫避光透析4小時,?4°C常溫避光再次透析過夜。

10.?0.22 μm注射器過濾頭過濾抗體溶液。

11.?0.01 M PBS/0.01 %?疊氮化鈉整數(shù)倍稀釋標(biāo)記抗體溶液,測量280nm(蛋白)和552nmCy)處的紫外可見吸光度。

12.?產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或在0.01 M PBS/ 0.01%?疊氮化鈉溶液中,-20避光儲存。


F/P計算:

SulfoCy3552nm摩爾吸光系數(shù)為150 000 M-1cm-1;此蛋白在280nm的摩爾吸光系數(shù)為170 000 M-1cm-1;不同蛋白的摩爾吸光系數(shù)不一樣;.Cy3?染料本身在280 nm?的吸收是552nm處的8%。按以下公式計算F/P值。

[Cy3] = A552/150000

[antibody] = {A280- (0.08×A552)}/170000?

F/P?final= [Cy3]/[antibody]= {1.13×A552}/ {A280- (0.08×A552)}

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