鈣黃綠素-AM (Calcein-AM)?和碘化丙啶?(PI)?溶液，分別對活細胞和死細胞染色，可用于同時對活細胞和死細胞進行熒光染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯親脂性很高，使其可透過細胞膜。盡管Calcein-AM本身并不是熒光分子，但通過活細胞內的酯酶作用，Calcein-AM能脫去AM基，產(chǎn)生的Calcein能發(fā)出強綠色熒光?(激發(fā): 490 nm，發(fā)射: 515 nm)。因此Calcein-AM僅對活細胞染色。另一方面，作為核染色染料的PI不能穿過活細胞的細胞膜。它穿過死細胞膜的無序區(qū)域而到達細胞核，并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光?(激發(fā): 535 nm，發(fā)射: 617 nm)。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞。用545 nm激發(fā)，僅可觀察到死細胞。由于不同細胞系的最佳染色條件不同，我們建議個別確定Calcein-AM和PI的合適濃度。
I. 試劑??Calcein-AM 4mM 50uL in DMSO; Unit Size #500 assays ·PI (2mM) 150uL in water
II. 操作說明
??用熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)，以HeLa細胞染色為例，請注意不同的細胞種類、不同濃度，有不同的觀察條件。根據(jù)細胞條件，摸索不同條件下的細胞貼壁情況和試劑濃度的配制等最佳條件。
1.?染色溶液的配制
1)?將Calcein-AM儲備液和PI儲備液平衡到室溫。
2)?分別加2.5 μl Calcein-AM原液和12.5 μl PI原液至5 mL PBS（pH=7.4）中配制成染色工作液。染色工作液中Calcein-AM的濃度為2 μmol/L，PI的濃度約為5 μmol/L。
2.?細胞染色
1)?染色HeLa細胞等貼壁細胞時，先用Trypsin-EDTA等消化細胞，制備成細胞懸液。
2)?將細胞懸液離心3分鐘?(1,000 rpm)。
3)?去除上清液，加入PBS緩沖液，細胞數(shù)量調整至105-106個/ml。再用移液器充分混勻。
4)?由于培養(yǎng)基中的血清等含有酯酶，Calcein-AM遇水會分解，會導致空白上升，所以需要離心數(shù)次，用PBS洗滌數(shù)次直到完全洗凈。
5)?將200 μl細胞懸液移至小試管中，加入100 μl染色工作液，在37℃下孵育15分鐘。
6)?在蓋玻片上滴加適量的染色的細胞溶液。
7)?在熒光顯微鏡下，先用490±10 nm波長激發(fā)，觀察黃綠色的活細胞，還可以同時觀察到紅色的死細胞，然后用545 nm波長激發(fā)，能夠看到紅色的死細胞。
??3.?染色試劑的最佳濃度
???Calcein-AM和PI最佳濃度根據(jù)細胞種類而定，通過以下的操作，可找到不同細胞染色試劑的最佳濃度。
1)?通過在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黃皂苷中孵育10分鐘或通過在70%乙醇中孵育30分鐘制備死細胞。
2)?用0.1-10 μM PI溶液對死細胞染色，以便找到僅對細胞核染色而不對細胞質染色的PI濃度。
3)?用0.1-10 μM Calcein-AM溶液對死細胞染色，以便找到不對細胞質染色的Calcein-AM濃度。接著用該濃度的Calcein-AM對活細胞染色以檢驗活細胞可否被染色。
III.?注意事項
1) Calcein-AM的ester部位遇到濕氣會分解，使用后請在-20度下密閉冷凍保存，防止水分進入。Calcein-AM儲備液用緩沖液或培養(yǎng)基等稀釋時盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。
2)?使用時一定要帶手套、眼罩、口罩。萬一接觸到皮膚的話，迅速使用大量水清洗。
