DiD,DiO,DiI,DiR 和 DiS 細(xì)胞膜染料
表1.??DiD,DiO,DiI,DiR,DiS的化學(xué)性質(zhì)
*?Omega濾光器由Omega公司提供(www. omegafilters.com);Chroma濾光器由Chroma公司提供(www. chroma.com)。
**DiR的發(fā)射波長(zhǎng)肉眼不可見,所以需要配備CCD鏡頭或其他的近紅外檢測(cè)儀器。
1. DiD,DiO,DiI,DiR和DiS細(xì)胞膜染色液制備
(1)配置DMSO或EtOH 儲(chǔ)存液:儲(chǔ)存液用 DMSO或EtOH配置濃度1~5 mM。
注意:未使用的儲(chǔ)存液保存在-20°C,避免反復(fù)凍融。
(2)工作液制備:用合適的緩沖液(如:無血清培養(yǎng)基,HBSS或PBS)稀釋儲(chǔ)存液,配制濃度為1~5 μM的工作液。
注意:工作液的最終濃度是根據(jù)不同細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)來配制??梢詮耐扑]濃度的十倍以上尋找最佳條件。?
(1)懸浮細(xì)胞密度為 1 × 106/mL加入到工作液中。
(2)在37 ℃培養(yǎng)細(xì)胞 2~20分鐘,不同的細(xì)胞最佳培養(yǎng)時(shí)間不同。
(3)染色細(xì)胞試管在1000~1500轉(zhuǎn)離心5分鐘。
(4)傾倒上清液,再次緩慢加入預(yù)溫37℃的培養(yǎng)液。
(1)使粘壁的細(xì)胞在無菌實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。
(2)從培養(yǎng)基中移走蓋玻片,吸走過量培養(yǎng)液,將蓋玻片放在潮濕的環(huán)境中。
(3)在蓋玻片的一角加入100μL的染料工作液,輕輕晃動(dòng)使染料均勻覆蓋所有細(xì)胞。
(4)在37 ℃培養(yǎng)細(xì)胞 2~20分鐘,不同的細(xì)胞最佳培養(yǎng)時(shí)間不同。
(5)吸干染料工作液,用培養(yǎng)液洗蓋玻片2~3次,每次用預(yù)溫的培養(yǎng)基覆蓋所有細(xì)胞,培養(yǎng)5~10分鐘,然后吸干培養(yǎng)基。
(1)DiD,DiO,DiI,DiR和DiS濾光器的選擇參見表1。
(2)多色染料的同時(shí)檢測(cè),濾光器按照以下設(shè)定:
a) DiI和DiO=Omega XF52,Chroma 51004;
b) DiI和DiD=Omega XF92,Chroma 51007;
c) DiI,DiO和DiD=Omega XF93,Chroma 61005
DiD,DiO,DiI,DiR和DiS 染色的細(xì)胞可以分別用經(jīng)典的FL1,F(xiàn)L2,F(xiàn)L3和FL4流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
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