用于 dsDNA 定量檢測的FBGreen熒光染料?（～PicoGreen）
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1.應用說明
??? 在分子生物學的試驗過程中，F(xiàn)BGreen dsDNA 定量試劑盒是熒光檢測雙鏈 DNA 并進行定量 的一種產(chǎn)品，這種方法非常靈敏。常用于分子生物學技術(shù)中的：cDNA 文庫的構(gòu)建；用于亞克隆的? DNA 片段純化及應用，比如進行 DNA 定量、產(chǎn)物擴增和引物的進一步檢測。 疫苗是現(xiàn)代疾病預防中常用的控制方式。如今許多疫苗是細胞培養(yǎng)疫苗，比如重組乙肝疫苗、狂犬病疫苗等大多數(shù)疫苗都采用細胞培養(yǎng)的方法生產(chǎn)。其中，疫苗的純化是關(guān)鍵問題，我們需要盡可能的去除宿主細胞DNA和宿主蛋白。假若宿主細胞的DNA和蛋白同疫苗一起注入人體將會產(chǎn)生不可預料的后果。
?? 常規(guī)的DNA含量的檢測方法是在260nm（A260）處測其吸光值。這種方法的主要缺點是核苷酸、單鏈核酸和蛋白質(zhì)對信號的影響很大，并且還會受到核酸制備過程中污染物的干擾，無法區(qū)分DNA和RNA，而且這種方法不靈敏（5μg/mLdsDNA溶液A260=0.1）。PicoGreen定量檢測方法簡單、方便，被多家生物制品廠所選擇，成為生物制品殘留DNA檢測的標準。目前該方法已納入2010年版《中國藥典》
原理:
?FBGreen與DNA雙鏈結(jié)合后才發(fā)出的熒光，無DNA不發(fā)熒光；所發(fā)熒光與DNA濃度成正比。在2010年《中國藥典》中提出，F(xiàn)BGreen定量DNA的方法檢出限約0.3ng/ml，DNA含量在1.25-80ng/mL范圍時線性較好(R2>0.99).
優(yōu)點：
1）該方法可以測定來源于任何表達宿主樣品中的雙鏈DNA。
?2）可以直接定量PCR擴增產(chǎn)物而無需從反應混合物中純化DNA。
?3）遠遠超出傳統(tǒng)紫外A260的檢測方法和Hoechst33258的靈敏度。
?4）較高濃度的鹽，尿素，乙醇，氯仿，去垢劑，蛋白或瓊脂糖對測定無影響。
5）在等摩爾濃度 ssDNA 和 RNA 存在的條件下測定 dsDNA，其影響很小。
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2.所需器材
? 微型熒光計；便攜式熒光儀-上?；娇茖W儀器有限公司HG-9型；1cm石英比色皿
? FBGreen dsDNA 定量檢測試劑盒， 1mL 單位量的試劑濃縮液足夠 2mL 體積的 200 次測定。
1×TE（10mM Tris 1mM EDTA）pH8.0； 250ug/mL Sigma 小牛胸腺DNA
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3.實驗方案
? 試劑制備
FBGreen dsDNA 定量試劑是以 1mL 的濃縮液形式保存在無水的 DMSO（二甲基亞砜）中。實 驗當天，配制 2XFBGreen 試劑的操作溶液，用 1xTE 按 1:200 的比例稀釋濃縮液（10mM Tris-HCl，
1mM EDTA，pH7.5）。如果要準備足夠的操作溶液測定 20 個樣品，可在 20mL1x TE 中加入 100μL FBGreen dsDNA 定量試劑。由于試劑容易吸附到玻璃表面，要在塑料容器中配制。PicoGreen 試劑 見光易降解，所以應將配好的溶液用箔包住或放置暗處避光保存。
溶液最好在配制好數(shù)小時內(nèi)使用，以保證最佳結(jié)果。
實驗方法：
1). 標準品工作液的配制：
?Sigma小牛胸腺嘧啶DNA干粉（貨號：D4522-1MG）1mg（Tris，Nacl等濃度已成標準體系），加入1mL雙蒸水，配制成1mg∕mL的標準品工作液；
2). 染料工作液的配置：
6 uLFBGreen加入1mL TE(注意：用1×TE將FBKGreen稀釋200倍，現(xiàn)用現(xiàn)配，注意避光)。
3). 標準品工作液稀釋：
（1）母液稀釋：取10ul（1mg∕mL）標準品工作液加入到990ul TE溶液中，濃度稀釋成10ug∕mL，取10ul（10ug∕mL）標準品工作液加入到990ul TE溶液中，濃度稀釋成100ng∕mL；
（2）倍比稀釋：取800ul （100ng∕mL）的標準品工作液加入到200ul TE溶液中，濃度達到80ng∕mL（藥典規(guī)定：熒光染色方法DNA含量在1.25-80 ng/mL范圍線性較好， 該法DNA檢出限為0.3 ng/ml），取500ul（80ng∕mL）的標準品工作液加入到500ul TE溶液中，濃度稀釋到40ng∕mL；依次倍比稀釋，配成20ng/ml、10ng/ml、5.0ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml的標準品溶液；
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4).標準曲線的制備：倍比稀釋后的各梯度標準品溶液和染料工作液各取100ul混勻，避光室溫放置5min。使用FB-15型便攜式熒光儀檢測樣品的熒光值：將混合后的溶液加入微量比色皿，確信不要在樣品中引入氣泡，輕輕地彈微量檢測皿的外部，可以驅(qū)散氣泡。以1×TE緩沖液為blank，測定樣品和空白對照的熒光值；用標準品溶液的濃度（ng/ml）對應的熒光強度作直線回歸，制備標準曲線。
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|
待測DNA最終濃度 (ng/ml) |
熒光讀值 |
100 |
6210 |
50 |
3195 |
40 |
2507 |
20 |
1261 |
10 |
620.8 |
5 |
298 |
4 |
258.8 |
2 |
152 |
0.5 |
43.8 |
0 |
0.72 |
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5). 測量剩余樣品的熒光值。熒光計將給出一個直接的濃度讀數(shù)，數(shù)據(jù)可以用來產(chǎn)生DNA 濃度的標準曲線。
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4 參考文獻
1)?????? Nucleic Acids Res. 24, 2623 (1996)
2)?????? BioTechniques 21, 372 (1996)
3)?????? BioTechniques 21, 664 (1996)
4)?? Proc. Natl. Acad. Sci. USA 936091 (1996)
5)?????? Anal. Biochem. 102, 344 (1980)，
6)?????? Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor, New York,1989
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