Super Fluor 488，555, 647, 680, 750 SE活化酯標記抗體
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1.產(chǎn)品簡介 ?
Super Fluor?系列（～Alexa Fluor?系列）熒光探針，具有更強的熒光強度，更廣的pH應用范圍（pH 4～10）,?更好的抗淬滅性。在生物熒光領(lǐng)域已逐漸替代FITC,Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7等熒光染料。?
表?Super Fluor 488，555, 647, 680, 750活化酯的性質(zhì)參數(shù)
488 |
555 |
647 |
680 |
750 |
|
活化酯分子量 |
～900 |
?～1250 |
?～1300 |
～1150 |
?～1300 |
最大吸收波長(nm) |
494 |
555 |
647 |
680 |
750 |
摩爾吸光系數(shù)(M-1cm-1) |
71 000 |
150 000 |
239 000 |
184000 |
240 000 |
最大發(fā)射波長(nm) |
524 |
565 |
665 |
702 |
775 |
A280nm?/Amax |
11% |
8% |
3% |
5％ |
4% |
?
2. Super Fluor 標記抗體的參考方案：
1)?蛋白溶解：用0.1 M NaHCO3溶解至終濃度為2mg/mL
???將1ml?去離子水加入84mgNaHCO3瓶中，配成1M?的碳酸氫鈉溶液。振蕩或吹打至完全溶解。該溶液pH?約8.3，2～6℃保存可用2?星期；若抗體是溶液，將抗體稀釋至2mg/mL，再加入1/10?體積的上述碳酸氫鈉溶液；若抗體是凍干粉，將1M?碳酸氫鈉溶液用10?倍去離子水稀釋成0.1M?后，用其將抗體溶成2mg/mL的溶液；
2）染料溶解：活化Super Flour SE染料固體粉末從冰箱放入干燥器中慢慢升至常溫后，用無水DMSO將染料配置濃度為1 mg/mL。
3）標記：在1mL蛋白溶液中緩慢加入適量染料溶液，（蛋白:染料摩爾比=1:20～50；質(zhì)量比可在以下范圍內(nèi)優(yōu)化10～200ug Super Flour SE?每毫克IgG抗體）。同時在暗處常溫緩慢攪拌1小時。也可以直接將蛋白溶液直接加入染料的固體粉末的試劑瓶中，同時在暗處常溫緩慢攪拌1小時。
4）純化：用透析法或者葡聚糖Sephadex純化產(chǎn)品后，產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或在0.01 M PBS/2mM疊氮化鈉溶液中，-20℃避光儲存。
5）貯存：標記好的蛋白貯存于2～6℃，避光。若純化的蛋白偶聯(lián)物濃度小于1mg/mL，加入BSA?或其他穩(wěn)定蛋白1～10mg/ml。在2mM?疊氮鈉存在的情況下，2～6?度可保存幾個月。保存更長時間，則需分裝后-20℃保存。避免反復凍融，避光保存。
3.計算標記比例F/P值：
對于IgG?等大多數(shù)抗體來說，摩爾吸光系數(shù)為203000，F/P值在4～9?之間是最合適。
Super Flour 647標記蛋白F/P值計算：
1）用PBS?精確倍數(shù)稀釋定量的少許純化過的偶聯(lián)蛋白，在1cm比色皿中測定280nm和650nm的光吸收；
2）計算樣品中的蛋白濃度：蛋白摩爾濃度=(A280-(A650×0.03))×稀釋倍數(shù)/203000
3）計算標記比例：每摩爾蛋白結(jié)合的染料摩爾數(shù)=A650×稀釋倍數(shù)/(239000×蛋白摩爾濃度)
4. 活性染料穩(wěn)定性與儲存：
?請注意：未開封的粉末在避光干燥-20℃可存放6月。其水溶液現(xiàn)配現(xiàn)用不能儲存。任何溶解后的染料最好立即使用；無水的DMSO溶液-20°C保存最多2個星期。
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