超氧化物歧化酶SOD活性檢測試劑盒(～WST-1法)
產品說明：
超氧化歧化酶（SOD）能夠催化超氧陰離子（O2?-）歧化，生成過生成過氧化氫(H2O2)和單質氧氣(O2)，是一種重要的抗氧化酶。目前有許多間接或者直接測定SOD的方法，其中，其中NBT(氮藍四唑)法由于使用方便而被廣泛使用，但是，NBT法有幾個缺點，例如生成的染料水溶性差，而且會和黃嘌呤氧化酶的還原型發(fā)生反應。雖然cytochrome C法也常被用來做SOD檢測，但它和超氧化物反應過于劇烈，不能測定低水平的SOD。SOD Assay Kit-WST-1使用了易溶于水的噻唑鹽：WST-1（2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯基)-2氫-四唑鹽,二鈉鹽），能夠和超氧陰離子反應生成水溶性的染料，因此可以簡便地進行SOD的檢測。WST-1與超氧陰離子反應的劇烈程度比cytochrome C小70倍；因此，它的檢測靈敏度非常高，并且能夠通過將樣品用buffer稀釋，使背景的吸光度最小化。WST-1不會和黃嘌呤氧化酶的還原型發(fā)生反應，因此，能夠檢測SOD100%的抑制率。WST-1被超氧陰離子還原的比率與黃嘌呤氧化酶的活性線性相關，并且會被SOD所抑制（見下圖）。因此，SOD或者SOD類似物的IC50(50%的抑制濃度)就能用比色法來測定。
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圖1.?基于黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應體系和WST-1的SOD酶活力檢測原理圖。XO：xanthine oxidase。
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目前測定SOD比較先進的方法包括WST-1法和WST-8法，其中WST-8法比WST-1法更加穩(wěn)定、靈敏度更高。本試劑盒采用了目前測定SOD方法中穩(wěn)定性和靈敏度較好的WST-1法。
WST-1的反應產物是穩(wěn)定的水溶性產物，可以通過單個時間點的吸光度檢測來測定SOD活力，適合高通量篩選研究。同時WST-1法測定SOD酶活力時，最大抑制百分率可以接近100%，并且可以不受一些常見的干擾因素的干擾，使檢測效果比其它的一些常見方法顯著改善。
本試劑盒的性能優(yōu)于同類產品總SOD活性檢測試劑盒(NBT法)。本產品的用途與同類產品總SOD活性檢測試劑盒(NBT法)相同，等量SOD導致的吸光度變化值顯著大于NBT法，線性范圍更寬。本試劑盒提供的SOD樣品制備液能直接裂解細胞，無需勻漿，操作更加便捷。
???本試劑盒的檢測不受樣品中過氧化氫的干擾。很多細胞和組織樣品中含有內源性的過氧化氫，會干擾SOD的檢測。本試劑盒通過添加適量過氧化氫酶等特殊方法，能有效去除常規(guī)樣品中過氧化氫的干擾。例如，對于SOD標準品的檢測，標準品中添加高達0.1mM的過氧化氫時，對于檢測結果仍無顯著影響。本試劑盒可以檢測細胞或組織勻漿液上清、全血、紅細胞抽提物、血清(漿)、胸水、腹水、腎透析液、尿液、紅細胞、白細胞、血小板、心肌培養(yǎng)細胞、腫瘤培養(yǎng)細胞、各種動植物組織細胞級亞細胞等生物樣品中的SOD活力。
試劑盒組份：
產品編號 |
產品名稱 |
規(guī)格 |
價格 |
F311-100T |
總SOD活性檢測試劑盒(～WST-1法) |
100次 |
568元 |
產品組分編號 |
產品組份名稱 |
包裝 |
保存 |
F311-1 |
SOD樣品制備液 |
50mL |
-20°C避光1年 |
F311-2 |
SOD檢測緩沖液 |
50ml |
|
F311-3 |
WST-1 |
0.8mL |
|
F311-4 |
酶溶液 |
0.1ml |
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F311-5 |
反應啟動液(40X) |
0.06ml |
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注意事項：
1)??????標準品稀釋時所用的稀釋液應盡量與樣品一致。樣品用試劑盒提供的SOD樣品制備液制備時，標準品也宜使用SOD樣品制備液進行稀釋；當樣品為血液等無需處理的樣品時，宜使用試劑盒提供的SOD檢測緩沖液稀釋標準品。
2)??????酶溶液有時會被分成兩層，因此忽略移液器混合步驟會導致實驗結果不準確。
3)??????為提高實驗準確性，建議每個樣品進行復孔實驗。
4)??????本產品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
5)??????為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
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使用方法：
1.樣品的準備：?
a)?細胞樣品的準備：
對于貼壁細胞，吸凈細胞培養(yǎng)液，用4℃或冰浴預冷的PBS或生理鹽水洗滌一遍，按照每100萬細胞加入100-200微升的比例加入本試劑盒提供的SOD樣品制備液，適當吹打以充分裂解細胞；對于懸浮細胞，600g離心5分鐘收集細胞，用4℃或冰浴預冷的PBS或生理鹽水洗滌一遍，按照每100萬細胞加入100-200微升的比例加入SOD樣品制備液，適當吹打，以充分裂解細胞。4℃約12,000g離心3-5分鐘，取上清作為待測樣品。
b)?組織樣品的準備：
動物用生理鹽水(0.9% NaCl，含有0.16mg/ml肝素鈉)灌流清除血液后獲取組織樣品。取適量的組織樣品，按照每10mg組織加入100微升SOD樣品制備液的比例在4℃或冰浴進行勻漿(可以使用玻璃勻漿器或各類常見電動勻漿器)。4℃約12,000g離心3-5分鐘，取上清作為待測樣品。
c)?血漿或紅細胞樣品的準備：
用抗凝管收集血液，顛倒混勻。4℃?600g離心10分鐘，移取上清至另一新的1ml離心管中，適量生理鹽水稀釋后即可作為血漿樣本進行檢測。紅細胞樣品可以參考步驟1a?懸浮細胞樣品的制備方法，或其它不含Triton?X-100等去垢劑的樣品制備方法。
d)?上述樣品準備完畢后可以BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。通常10-20微克蛋白的細胞或組織勻漿液樣品中的SOD平均活力約1個活力單位左右(不同細胞和組織的差異會比較大，該活力范圍僅作為初步的參考)。每種樣品準備20-100微克蛋白量通常已經足夠用于后續(xù)檢測。
e)?根據(jù)蛋白濃度和預計的蛋白使用量，用本試劑盒提供的SOD檢測緩沖液適當稀釋樣品。例如，小鼠肝臟組織10%勻漿液(組織和勻漿液的重量比為1:10)上清，通常需要稀釋10-100倍。準備好的樣品如果當天測定，可以冰浴保存；如果當天不能完成測定，可以-70℃凍存，但建議盡量當天完成測定。
2.試劑盒的準備工作：
a) WST-1/酶工作液的配制：按照每個反應160μl的體積配制適量的WST-1/酶工作液。均勻混合151μl?SOD檢測緩沖液、8uL WST-1和1ul酶溶液，即可配制成160μl?WST-1/酶工作液。根據(jù)待檢測樣品(包括標準品)的數(shù)量，配制適量的WST-1/酶工作液。具體配制方法可以參考下表。配制好的WST-1/酶工作液4℃或冰浴保存，可以在當天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。注意：由于酶溶液的用量較少且易沉降，必須注意在使用前先輕輕離心一下，然后適當混勻后再使用。
待測樣品數(shù)量 |
1 |
10 |
20 |
50 |
SOD檢測緩沖液(uL) |
151 |
1510 |
3020 |
7550 |
WST-1(uL) |
8 |
80 |
160 |
400 |
酶溶液(uL) |
1 |
10 |
20 |
50 |
WST-1/酶工作液(uL) |
160 |
1600 |
3200 |
8000 |
b)?反應啟動工作液的配制：把試劑盒中的反應啟動液(40X)融解后混勻，按照每1μl反應啟動液(40X)加入39μl?SOD檢測緩沖液的比例進行稀釋，混勻后即為反應啟動工作液。根據(jù)待檢測樣品(包括標準品)的數(shù)量，配制適量的反應啟動工作液。配制好的反應啟動工作液4℃或冰浴保存，可以在當天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。
c) (可選做)SOD標準品準備：需自備SOD標準品，用本試劑盒提供的SOD樣品制備液(當樣品用試劑盒提供的SOD樣品制備液制備時)或SOD檢測緩沖液(當樣品為血液等無需處理的樣品時)將SOD標準品稀釋至如下系列濃度：100U/ml，50U/ml，20U/ml，10U/ml，5U/ml，2U/ml，1U/ml。在隨后的檢測中可以各取20微升，參考樣品進行檢測。SOD標準品的檢測效果參考圖2。說明：為避免稀釋后SOD酶活性的下降，SOD標準品宜現(xiàn)稀釋現(xiàn)使用；本試劑盒對于SOD的檢測并不需要SOD作為標準品，但可以使用SOD標準品作為陽性對照或作為對SOD活性定量的參考。
3.樣品測定：
a)?參考下表使用96孔板設置樣品孔和各種空白對照孔。并按下表依次加入待測樣品和其它各種溶液。加入反應啟動工作液后充分混勻。注意：加入反應啟動工作液后反應即會開始，可以在低溫操作或用排槍操作以減小各孔間因加入反應啟動工作液的時間先后差異而導致的誤差。
樣品(Sample)/標準品 |
空白對照1(Blank1) |
空白對照2(Blank2) |
空白對照3 (Blank3)* |
|
待測樣品 |
20μl |
－ |
－ |
20μl |
SOD檢測緩沖液 |
－ |
20μl |
40μl |
20μl |
WST-1/酶工作液 |
160μl |
160μl |
160μl |
160μl |
反應啟動工作液 |
20μl |
20μl |
－ |
－ |
*如果樣品有顏色或含有抗氧化物質，則需設置空白對照3；如果樣品沒有顏色并且也不含有抗氧化物則沒有必要設置空白對照3。
b) 37℃孵育30分鐘。說明：孵育25至35分鐘檢測出來的SOD活力無顯著差異，但為保證檢測結果的一致性，推薦孵育30分鐘。
c)?在450nm測定吸光度。如無450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片。可以選擇設定600nm (或600nm以上，如650nm)作為參比波長(也稱參考波長)，450nm吸光度的讀數(shù)扣除參比波長的吸光度讀數(shù)即可作為實測讀數(shù)。
4.樣品中總SOD活力的計算：
a)?抑制百分率的計算：
參考如下計算公式計算抑制百分率：
抑制百分率＝[(A空白對照1－A空白對照2)－(A樣品－A空白對照3)]/(A空白對照1－A空白對照2)×100%
如果樣品沒有顏色并且也不含有抗氧化物，則A空白對照2?= A空白對照3，此時可以把計算公式簡化 為如下形式(簡化時可以不設置空白對照3)：
抑制百分率 ＝?(A空白對照1－A樣品) / (A空白對照1－A空白對照2)?×?100%
如果計算出來的抑制百分率小于30%或大于70%，則通常需要把該樣品重新測定。盡量使樣品的抑制百分率在30-70%范圍內。如果測定出來的抑制百分率偏高，則需適當稀釋樣品；如果測定出來的抑制百分率偏低，則需重新準備濃度較高的待測樣品。
b) SOD酶活力單位的定義：在上述黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應體系中抑制百分率為50%時，反應體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位(unit)。注意：SOD的活力單位的定義方式有很多種，不同的活力單位需根據(jù)其定義的不同進行適當換算。
c) SOD酶活力的計算：
圖2.?本試劑盒對SOD標準品的檢測效果。圖A縱坐標ΔA450為孵育30分鐘后，空白對照1與SOD標準品孔的吸光度差值。SOD酶活力和ΔA450及抑制百分率(圖B)呈非線性關系，而1/SOD酶活力和1/抑制百分率成線性關系(圖C)。圖中數(shù)據(jù)僅作參考，實際測定獲得的標準曲線的斜率和截距可能會因具體反應條件的不同和上圖有較明顯的差別。
SOD酶活力的計算公式如下：
待測樣品中SOD酶活力單位＝檢測體系中SOD酶活力單位＝抑制百分率/(1－抑制百分率)units
例如，當抑制百分率為50%時，待測樣品中SOD酶活力單位＝50% / (1－50%)units＝1 unit；當抑制百分率為60%時，待測樣品中SOD酶活力單位＝60% / (1－60%)units＝1.5 units。
d.如果樣品為細胞或組織的勻漿液，可以根據(jù)樣品的蛋白濃度和稀釋倍數(shù)，將SOD活力單位換算為U/g或U/mg蛋白。如果樣品為紅細胞抽提液，可以根據(jù)血紅蛋白含量，可換算為U/克血紅蛋白或U/毫克血紅蛋白。
附1：SOD酶活力計算的參考方案：可以先使用本試劑盒繪制SOD標準品的抑制百分率曲線，然后根據(jù)樣品檢測到的抑制百分率對比標準品的抑制百分率曲線計算出樣品中的SOD酶活力單位。本方案僅供參考，使用本試劑盒時不必使用本方案進行檢測和計算。此外，本方案需確保標準品的酶活力數(shù)據(jù)可靠，不會因為標準品的保存問題而導致實際酶活力下降。
附2：SOD酶活力的動力學檢測：如果條件許可，使用本試劑盒時也可以使用動力學方法檢測SOD的酶活力。通常在步驟3a后可以37℃孵育同時在450nm連續(xù)測定吸光度30分鐘。根據(jù)30分鐘內的吸光度變化的斜率計算出抑制百分率：
抑制百分率＝[(斜率空白對照1－斜率空白對照2)－(斜率樣品－斜率空白對照3)]/(斜率空白對照1－斜率空白對照2)×100%
其余的計算方法同上述非動力學的計算方法。動力學方法的檢測和計算更加精確一些，但檢測起來相對要麻煩一些。使用本試劑盒通常使用非動力學方法即可。
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