總SOD活性檢測試劑盒(～WST-8法)

產(chǎn)品說明：

總SOD活性檢測試劑盒(WST-8法)(Total Superoxide Dismutase Assay Kit with WST-8)是一種基于WST-8的顯色反應(yīng)，通過比色來檢測細(xì)胞、組織或其它樣品中SOD即超氧化物歧化酶活性的試劑盒。
超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)能催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用，生成過氧化氫(H2O2)和氧氣(O2)，是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶。
目前有多種SOD活性測定法，其中NBT(氮藍(lán)四唑)法由于使用方便而被廣泛使用。但NBT法產(chǎn)生的甲臜染料水溶性差，易和被還原的黃嘌呤氧化酶相互作用，抑制百分率達(dá)不到100%等，從而使檢測的靈敏度和精確度受到影響；細(xì)胞色素C法也是一種常用來檢測SOD活性的方法，但細(xì)胞色素C其氧化活性高，易受樣品中的還原劑干擾，另外該方法需要連續(xù)測定吸光度值，對于SOD的檢測靈敏度比較低，并且不太適合大批量樣本的檢測。
目前測定SOD比較先進(jìn)的方法包括WST-1法和WST-8法，其中WST-8法比WST-1法更加穩(wěn)定、靈敏度更高。本試劑盒采用了目前測定SOD方法中穩(wěn)定性更好、靈敏度更高的WST-8法，可以檢測出低達(dá)0.5U/ml的超氧化物歧化酶。WST-8法的原理參考圖1，WST-8可以和黃嘌呤氧化酶(Xanthine?Oxidase,?XO)催化產(chǎn)生的超氧化物陰離子(O₂^.-)反應(yīng)產(chǎn)生水溶性的甲臜染料(formazan?dye)，由于SOD能催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用，所以該反應(yīng)步驟可以被SOD所抑制，因此SOD的活性與甲臜染料的生成量成負(fù)相關(guān)，從而通過對WST-8產(chǎn)物的比色分析即可計算SOD的酶活力。

圖1.?基于黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體系和WST-8的SOD酶活力檢測原理圖。XO：xanthine oxidase。

WST-8的反應(yīng)產(chǎn)物是穩(wěn)定的水溶性產(chǎn)物，可以通過單個時間點的吸光度檢測來測定SOD活力，適合高通量篩選研究。同時WST-8法測定SOD酶活力時，最大抑制百分率可以接近100%，并且可以不受一些常見的干擾因素的干擾，使檢測效果比其它的一些常見方法顯著改善。
本試劑盒的性能優(yōu)于同類產(chǎn)品總SOD活性檢測試劑盒(NBT法)。本產(chǎn)品的用途與同類產(chǎn)品總SOD活性檢測試劑盒(NBT法)相同，等量SOD導(dǎo)致的吸光度變化值顯著大于NBT法，線性范圍更寬。本試劑盒提供的SOD樣品制備液能直接裂解細(xì)胞，無需勻漿，操作更加便捷。
本試劑盒的檢測不受樣品中過氧化氫的干擾。很多細(xì)胞和組織樣品中含有內(nèi)源性的過氧化氫，會干擾SOD的檢測。本試劑盒通過添加適量過氧化氫酶等特殊方法，能有效去除常規(guī)樣品中過氧化氫的干擾。例如，對于SOD標(biāo)準(zhǔn)品的檢測，標(biāo)準(zhǔn)品中添加高達(dá)0.1mM的過氧化氫時，對于檢測結(jié)果仍無顯著影響。本試劑盒可以檢測細(xì)胞或組織勻漿液上清、全血、紅細(xì)胞抽提物、血清(漿)、胸水、腹水、腎透析液、尿液、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、心肌培養(yǎng)細(xì)胞、腫瘤培養(yǎng)細(xì)胞、各種動植物組織細(xì)胞級亞細(xì)胞等生物樣品中的SOD活力。

試劑盒組份：

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注意事項：

1)??????待測樣品-70℃可保存1個月。需注意反復(fù)凍融會導(dǎo)致SOD部分失活。

2)??????標(biāo)準(zhǔn)品稀釋時所用的稀釋液應(yīng)盡量與樣品一致。樣品用試劑盒提供的SOD樣品制備液制備時，標(biāo)準(zhǔn)品也宜使用SOD樣品制備液進(jìn)行稀釋；當(dāng)樣品為血液等無需處理的樣品時，宜使用試劑盒提供的SOD檢測緩沖液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。

3)??????抗氧化物會對本試劑盒的檢測產(chǎn)生干擾，例如0.1mM ascorbic acid，5mM GSH都會使測定出來的吸光度顯著升高。此時盡管樣品沒有顏色，如果設(shè)置了使用說明中的空白對照3，就可以消除樣品中的抗氧化物的干擾。

4)??????本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

5)??????為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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使用方法：
1.樣品的準(zhǔn)備：?
a)?細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：對于貼壁細(xì)胞，吸凈細(xì)胞培養(yǎng)液，用4℃或冰浴預(yù)冷的PBS或生理鹽水洗滌一遍，按照每100萬細(xì)胞加入100-200微升的比例加入本試劑盒提供的SOD樣品制備液，適當(dāng)吹打以充分裂解細(xì)胞；對于懸浮細(xì)胞，600g離心5分鐘收集細(xì)胞，用4℃或冰浴預(yù)冷的PBS或生理鹽水洗滌一遍，按照每100萬細(xì)胞加入100-200微升的比例加入SOD樣品制備液，適當(dāng)吹打，以充分裂解細(xì)胞。4℃約12,000g離心3-5分鐘，取上清作為待測樣品。

b)?組織樣品的準(zhǔn)備：動物用生理鹽水(0.9% NaCl，含有0.16mg/ml肝素鈉)灌流清除血液后獲取組織樣品。取適量的組織樣品，按照每10mg組織加入100微升SOD樣品制備液的比例在4℃或冰浴進(jìn)行勻漿(可以使用玻璃勻漿器或各類常見電動勻漿器)。4℃約12,000g離心3-5分鐘，取上清作為待測樣品。
c)?血漿或紅細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：用抗凝管收集血液，顛倒混勻。4℃?600g離心10分鐘，移取上清至另一新的1ml離心管中，適量生理鹽水稀釋后即可作為血漿樣本進(jìn)行檢測。紅細(xì)胞樣品可以參考步驟1a?懸浮細(xì)胞樣品的制備方法，或其它不含Triton?X-100等去垢劑的樣品制備方法。
d)?上述樣品準(zhǔn)備完畢后可以BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。通常10-20微克蛋白的細(xì)胞或組織勻漿液樣品中的SOD平均活力約1個活力單位左右(不同細(xì)胞和組織的差異會比較大，該活力范圍僅作為初步的參考)。每種樣品準(zhǔn)備20-100微克蛋白量通常已經(jīng)足夠用于后續(xù)檢測。
e)?根據(jù)蛋白濃度和預(yù)計的蛋白使用量，用本試劑盒提供的SOD檢測緩沖液適當(dāng)稀釋樣品。例如，小鼠肝臟組織10%勻漿液(組織和勻漿液的重量比為1:10)上清，通常需要稀釋10-100倍。準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)天測定，可以冰浴保存；如果當(dāng)天不能完成測定，可以-70℃凍存，但建議盡量當(dāng)天完成測定。
2.試劑盒的準(zhǔn)備工作：
a) WST-8/酶工作液的配制：按照每個反應(yīng)160μl的體積配制適量的WST-8/酶工作液。均勻混合151μl?SOD檢測緩沖液、8μl WST-8和1μl酶溶液，即可配制成160μl?WST-8/酶工作液。根據(jù)待檢測樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)的數(shù)量，配制適量的WST-8/酶工作液。具體配制方法可以參考下表。配制好的WST-8/酶工作液4℃或冰浴保存，可以在當(dāng)天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。注意：由于酶溶液的用量較少且易沉降，必須注意在使用前先輕輕離心一下，然后適當(dāng)混勻后再使用。

b)?反應(yīng)啟動工作液的配制：把試劑盒中的反應(yīng)啟動液(40X)融解后混勻，按照每1μl反應(yīng)啟動液(40X)加入39μl?SOD檢測緩沖液的比例進(jìn)行稀釋，混勻后即為反應(yīng)啟動工作液。根據(jù)待檢測樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)的數(shù)量，配制適量的反應(yīng)啟動工作液。配制好的反應(yīng)啟動工作液4℃或冰浴保存，可以在當(dāng)天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。
c) (可選做)SOD標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備：需自備SOD標(biāo)準(zhǔn)品，用本試劑盒提供的SOD樣品制備液(當(dāng)樣品用試劑盒提供的SOD樣品制備液制備時)或SOD檢測緩沖液(當(dāng)樣品為血液等無需處理的樣品時)將SOD標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至如下系列濃度：100U/ml，50U/ml，20U/ml，10U/ml，5U/ml，2U/ml，1U/ml。在隨后的檢測中可以各取20微升，參考樣品進(jìn)行檢測。SOD標(biāo)準(zhǔn)品的檢測效果參考圖2。說明：為避免稀釋后SOD酶活性的下降，SOD標(biāo)準(zhǔn)品宜現(xiàn)稀釋現(xiàn)使用；本試劑盒對于SOD的檢測并不需要SOD作為標(biāo)準(zhǔn)品，但可以使用SOD標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照或作為對SOD活性定量的參考。

3.樣品測定：
a)?參考下表使用96孔板設(shè)置樣品孔和各種空白對照孔。并按下表依次加入待測樣品和其它各種溶液。加入反應(yīng)啟動工作液后充分混勻。注意：加入反應(yīng)啟動工作液后反應(yīng)即會開始，可以在低溫操作或用排槍操作以減小各孔間因加入反應(yīng)啟動工作液的時間先后差異而導(dǎo)致的誤差。

*如果樣品有顏色或含有抗氧化物質(zhì)，則需設(shè)置空白對照3；如果樣品沒有顏色并且也不含有抗氧化物則沒有必要設(shè)置空白對照3。
b) 37℃孵育30分鐘。說明：孵育25至35分鐘檢測出來的SOD活力無顯著差異，但為保證檢測結(jié)果的一致性，推薦孵育30分鐘。
c)?在450nm測定吸光度。如無450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片?？梢赃x擇設(shè)定600nm (或600nm以上，如650nm)作為參比波長(也稱參考波長)，450nm吸光度的讀數(shù)扣除參比波長的吸光度讀數(shù)即可作為實測讀數(shù)。

4.樣品中總SOD活力的計算：
a)?抑制百分率的計算：
參考如下計算公式計算抑制百分率：
抑制百分率＝[(A_{空白對照1}－A_{空白對照2})－(A_樣品－A_{空白對照3})]/(A_{空白對照1}－A_{空白對照2})×100%
如果樣品沒有顏色并且也不含有抗氧化物，則A_{空白對照2}?= A_{空白對照3}，此時可以把計算公式簡化 為如下形式(簡化時可以不設(shè)置空白對照3)：
抑制百分率 ＝?(A_{空白對照1}－A_樣品) / (A_{空白對照1}－A_{空白對照2})?×?100%
如果計算出來的抑制百分率小于30%或大于70%，則通常需要把該樣品重新測定。盡量使樣品的抑制百分率在30-70%范圍內(nèi)。如果測定出來的抑制百分率偏高，則需適當(dāng)稀釋樣品；如果測定出來的抑制百分率偏低，則需重新準(zhǔn)備濃度較高的待測樣品。
b) SOD酶活力單位的定義：在上述黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位(unit)。注意：SOD的活力單位的定義方式有很多種，不同的活力單位需根據(jù)其定義的不同進(jìn)行適當(dāng)換算。
c) SOD酶活力的計算：

圖2.?本試劑盒對SOD標(biāo)準(zhǔn)品的檢測效果。圖A縱坐標(biāo)ΔA450為孵育30分鐘后，空白對照1與SOD標(biāo)準(zhǔn)品孔的吸光度差值。SOD酶活力和ΔA450及抑制百分率(圖B)呈非線性關(guān)系，而1/SOD酶活力和1/抑制百分率成線性關(guān)系(圖C)。圖中數(shù)據(jù)僅作參考，實際測定獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距可能會因具體反應(yīng)條件的不同和上圖有較明顯的差別。

SOD酶活力的計算公式如下：
待測樣品中SOD酶活力單位＝檢測體系中SOD酶活力單位＝抑制百分率/(1－抑制百分率)units
例如，當(dāng)抑制百分率為50%時，待測樣品中SOD酶活力單位＝50% / (1－50%)units＝1 unit；當(dāng)抑制百分率為60%時，待測樣品中SOD酶活力單位＝60% / (1－60%)units＝1.5 units。
d.如果樣品為細(xì)胞或組織的勻漿液，可以根據(jù)樣品的蛋白濃度和稀釋倍數(shù)，將SOD活力單位換算為U/g或U/mg蛋白。如果樣品為紅細(xì)胞抽提液，可以根據(jù)血紅蛋白含量，可換算為U/克血紅蛋白或U/毫克血紅蛋白。
附1：SOD酶活力計算的參考方案：可以先使用本試劑盒繪制SOD標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線，然后根據(jù)樣品檢測到的抑制百分率對比標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線計算出樣品中的SOD酶活力單位。本方案僅供參考，使用本試劑盒時不必使用本方案進(jìn)行檢測和計算。此外，本方案需確保標(biāo)準(zhǔn)品的酶活力數(shù)據(jù)可靠，不會因為標(biāo)準(zhǔn)品的保存問題而導(dǎo)致實際酶活力下降。
附2：SOD酶活力的動力學(xué)檢測：如果條件許可，使用本試劑盒時也可以使用動力學(xué)方法檢測SOD的酶活力。通常在步驟3a后可以37℃孵育同時在450nm連續(xù)測定吸光度30分鐘。根據(jù)30分鐘內(nèi)的吸光度變化的斜率計算出抑制百分率：
抑制百分率＝[(斜率_{空白對照1}－斜率_{空白對照2})－(斜率_樣品－斜率_{空白對照3})]/(斜率_{空白對照1}－斜率_{空白對照2})×100%
其余的計算方法同上述非動力學(xué)的計算方法。動力學(xué)方法的檢測和計算更加精確一些，但檢測起來相對要麻煩一些。使用本試劑盒通常使用非動力學(xué)方法即可。

特別提醒：

1) 本公司所有產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員用于生命科學(xué)研究，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅。

2)?本公司所有產(chǎn)品必須由合格專業(yè)技術(shù)人員操作同時佩戴口罩/手套/實驗服并遵守生物實驗室安全操作規(guī)程！