細(xì)胞凋亡熒光Hoechst 33342 /PI?雙染試劑盒

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產(chǎn)品描述：

Hoechst?33342/PI?雙染試劑盒（Hoechst?33342/PI?Double?Stain?Kit）采用Hoechst 33342和碘化丙啶（PI）雙染的方法以區(qū)分凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的試劑盒。其檢測(cè)原理是：

熒光染料?Hoechst 33342?能少許進(jìn)入正常細(xì)胞膜，使其染上低藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的膜通透性增強(qiáng)，因此進(jìn)入凋亡細(xì)胞中的Hoechst 33342?比正常細(xì)胞的多，熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中要高，此外，凋亡細(xì)胞的染色體DNA?的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變從而使該染料能更有效地與DNA?結(jié)合，并且凋亡細(xì)胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst 33342?排出到細(xì)胞外使之在細(xì)胞內(nèi)積累增加等都使凋亡細(xì)胞的藍(lán)色熒光增強(qiáng)。

PI?染料是不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞中，即活細(xì)胞對(duì)PI?染料拒染，而壞死細(xì)胞由于膜完整性在早期即已破損，可被PI?染料染色。

根據(jù)這些特性，經(jīng)上述兩種染料雙染后使用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)時(shí)將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)別開來(lái)。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，這三群細(xì)胞表現(xiàn)分別為：正常細(xì)胞為低藍(lán)色/低紅色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡細(xì)胞為高藍(lán)色/低紅色（Hoechst33342++/PI+），壞死細(xì)胞為低藍(lán)色/高紅色（Hoechst 33342+/PI++）。

本試劑盒染色快速方便，兩種染料的染色僅需20-30分鐘，一步染色即可完成?？捎靡徊椒ɑ蛘邇刹椒ㄟM(jìn)行染色。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，無(wú)需稀釋等配制過(guò)程，也無(wú)需再準(zhǔn)備其它任何溶液。本試劑盒足夠檢測(cè)100個(gè)樣品，每個(gè)樣品的細(xì)胞數(shù)量可達(dá)10⁵-10⁶個(gè)。

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試劑盒組份：

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使用方法：
1.?懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞離心收集，固定培養(yǎng)的細(xì)胞消化收集后，將10⁵~10⁶?個(gè)細(xì)胞懸浮于1ml?培養(yǎng)基中，離心棄上清。細(xì)胞沉淀用0.8-1毫升細(xì)胞染色緩沖液重懸浮細(xì)胞。

2.?加入5微升Hoechst染色液。
3.??加入5微升PI染色液。
4.?混勻，冰浴或4℃孵育20-30分鐘。

5.?用流式細(xì)胞儀檢測(cè)紅色熒光和藍(lán)色熒光。

6.?如果使用熒光顯微鏡檢測(cè)，檢測(cè)前離心沉淀細(xì)胞，用PBS洗滌一次，再涂片觀察紅色熒光和藍(lán)色熒光。對(duì)于貼壁細(xì)胞使用熒光顯微鏡檢測(cè)，可以不收集細(xì)胞，直接依次按照上述比例加入細(xì)胞染色緩沖液、Hoechst染色液和PI染色液冰浴或4℃染色20-30分鐘。染色后PBS洗滌一次，再在熒光顯微鏡下觀察。流式細(xì)胞儀分析或熒光顯微鏡觀察：Heochst 33342?用氪激光激發(fā)的紫外光，激發(fā)波長(zhǎng)為352nm，發(fā)射波長(zhǎng)為400 ~ 500nm，產(chǎn)生藍(lán)色熒光；PI?用氬離子激光激發(fā)熒光，激發(fā)光波波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射光波波長(zhǎng)大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光。分析藍(lán)色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖或地形圖。結(jié)果判斷：在藍(lán)色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖上，結(jié)果為：正常細(xì)胞為低藍(lán)光/低紅光，凋亡細(xì)胞為高藍(lán)光/低紅光，壞死細(xì)胞為低藍(lán)光/高紅光。

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注意事項(xiàng)
1)?在紅色熒光對(duì)藍(lán)色熒光散點(diǎn)圖上，還可見到細(xì)胞凋亡區(qū)向細(xì)胞壞死區(qū)遷移的軌跡，可能是凋亡細(xì)胞的DNA進(jìn)一步降解的緣故。
2)?用Heochst 33342?染料與細(xì)胞孵育的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般控制在20min?之內(nèi)為宜。如果太長(zhǎng)可引起Heochst33342?的發(fā)射光譜由藍(lán)光向紅光的遷移，導(dǎo)致紅色熒光與藍(lán)色熒光的比例改變，從而影響結(jié)果的判斷。

3)熒光染料都存在淬滅的問(wèn)題，建議染色后盡量當(dāng)天完成檢測(cè)。

4)為減緩熒光淬滅可以使用抗熒光淬滅封片液。

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