基因轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑Polybrene (hexadimethrine bromide)?

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產(chǎn)品介紹：

Polybrene（聚凝胺）是一種多聚陽(yáng)離子聚合物，常用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以增強(qiáng)脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。Polybrene目前廣泛用于逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染，慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染，作用機(jī)理可能是通過(guò)中和細(xì)胞表面唾液酸與病毒顆粒之間的靜電排斥從而促進(jìn)吸附作用。Polybrene也是一種有名的抗肝素劑（肝素拮抗劑），常用來(lái)生產(chǎn)非特異性凝集的紅細(xì)胞。另外Polybrene也多用于蛋白測(cè)序，因?yàn)樾┝康?/span>Polybrene在自動(dòng)測(cè)序分析可明顯改善多肽的降解現(xiàn)象。PVDF膜加入polybrene還能提高膜的親和性。本產(chǎn)品為即用型溶液，粉末用0.9%NaCl?配置成10mg/ml?的溶液，并用0.22μM?濾膜過(guò)濾除菌。使用時(shí)一般按1:1000-1：2000?稀釋?zhuān)兰?xì)胞種類(lèi)不同稀釋比例不同，具體查閱相關(guān)文獻(xiàn)。注：Polybrene對(duì)某些細(xì)胞（如末端分化的神經(jīng)元，DC細(xì)胞）毒性較大，初次應(yīng)用建議先做毒性測(cè)試。?

試劑盒組份：

操作說(shuō)明：（僅作參考）：
實(shí)驗(yàn)1：逆轉(zhuǎn)錄病毒感染（Retroviral?Infection）
（1）?重組逆轉(zhuǎn)錄病毒原液的制備：取5ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基（5%血清）加入約含單層轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄包裝細(xì)胞的100mm培養(yǎng)盤(pán)內(nèi)。孵育24h后，吸去培養(yǎng)液并用0.45μm濾器過(guò)濾。
（2）待感染細(xì)胞的培養(yǎng)：100mm培養(yǎng)盤(pán)內(nèi)加入10ml完全培養(yǎng)基，細(xì)胞密度為5×105/盤(pán)。
（3）病毒感染：細(xì)胞培養(yǎng)24h后，吸去完全培養(yǎng)液。用含polybrene的2ml病毒上清?（或?qū)⒉《驹合♂尩?/span>2ml）感染細(xì)胞，polybrene的終濃度為5μg-10μg/ml。37°C孵育3-6h。
（4）收集病毒顆粒：加入8ml完全培養(yǎng)基。感染3天后，按照1:5的比例用選擇培養(yǎng)基裂解細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)2：轉(zhuǎn)染
（1）完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,培養(yǎng)細(xì)胞密度約50%；
（2）孵育細(xì)胞18-24h后準(zhǔn)備DNA-培養(yǎng)基-?Polybrene混合液，按如下操作制備混合液：①添加完全培養(yǎng)基（60mm培養(yǎng)皿2ml，100mm培養(yǎng)皿3ml）37°C預(yù)熱；②添加10ng~10μg質(zhì)粒輕輕混勻；③加入Polybrene至終濃度為5μg-10μg/ml。輕輕混勻。以上每個(gè)成分需要按順序加入。
（3）去除培養(yǎng)基，在細(xì)胞中加入DNA-培養(yǎng)基-Polybrene溶液，在37°C孵育細(xì)胞6-20h。細(xì)胞培養(yǎng)的前6h內(nèi)約每1.5h輕柔混勻。
（4）去除DNA-培養(yǎng)基-Polybrene溶液。用DMSO shock solution（15%DMSO in?1X HBSS）輕輕蓋住細(xì)胞（60mm培養(yǎng)
（5）立即去除DMSO shock solution，用完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基輕輕清洗細(xì)胞2次。對(duì)于60mm培養(yǎng)皿每次用5ml培養(yǎng)液清洗，100mm培養(yǎng)皿每次用10ml培養(yǎng)液清洗。皿3ml，100mm培養(yǎng)皿4ml）。每次加入溶液時(shí)用手輕晃培養(yǎng)盤(pán)10s，使得液體均勻分布。然后37°C孵育細(xì)胞4min。
（6）加入完全培養(yǎng)基到細(xì)胞中；
（7）穩(wěn)定轉(zhuǎn)化：去除生長(zhǎng)培養(yǎng)基，按照1:5的比例用選擇培養(yǎng)基裂解細(xì)胞。瞬時(shí)表達(dá)：去除生長(zhǎng)培養(yǎng)基，加入新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。24-72h后收獲細(xì)胞。

使用濃度（詳細(xì)步驟見(jiàn)文獻(xiàn)）：
Polybrene的具體使用濃度依據(jù)細(xì)胞種類(lèi)，轉(zhuǎn)染方法等影響，以下使用濃度僅作參考。
（1）為提高腺病毒轉(zhuǎn)染效率和LacZ轉(zhuǎn)基因表達(dá)，使用6μg/ml?Polybrene處理病毒載體后轉(zhuǎn)入BHK-21細(xì)胞（MOI為100），轉(zhuǎn)染率提高到95%，沒(méi)有用Polybrene處理的只有2.3%轉(zhuǎn)染率。
（2）在KSHV(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus)純化和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，濃縮的病毒與8ug/ml Polybrene加到BCBL-1細(xì)胞中37℃下孵育2h。
（3)?在逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建研究中，用v-rasHa逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染角質(zhì)細(xì)胞（Keratinocytes）后在含有4μg/ml Polybrene培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，病毒滴度為1×107?virus/ml，MOI為1[4]。
（4)?在shRNA編碼的慢病毒載體的轉(zhuǎn)染研究中，病毒上清中加入8μg/ml Polybrene，轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中[5]。
（5)?在慢病毒shRNA轉(zhuǎn)染研究中，將含有6μg/ml Polybrene的新鮮培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)24h的RCC10細(xì)胞中，用慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

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